产品简介：

本产品可从体外培养的贴壁细胞中提取迁移体并进行纯化。

本产品仅供科研使用，不得用于任何临床诊断、治疗或其他医疗用途。

产品应用：

提取后的迁移体可用于荧光染色成像分析、流式分析、核酸提取、蛋白提取及生化分析、质谱分析、下游细胞功能实验等

适配细胞种类：

首选细胞种类为贴壁并具有一定迁移能力的细胞，并进行过促进迁移体生产的改造，例如L929-Tspan4，NRK-Tspan4，HEK293T-Tspan4等。

可适配未经过促进迁移体生产改造的细胞系及原代细胞，如MGC803, RAW264.7, 各类MSC等，但此类细胞中迁移体产量波动较大，需要进行一定预实验确立最佳生产条件及产量。

不适配几乎无迁移的细胞，以及贴壁过于牢固的一些细胞种类。悬浮细胞未经测试。

产品优势

技术可靠：源自迁移体发现者实验室，经过多重验证

适配多种细胞系：目前迁移体研究常用细胞系已优化

可用于后续多种实验：兼容成像类、生化类、质谱类、功能类等实验

实验流程：

组分及保存条件：

提取效果展示：

试剂盒提取后获得迁移体的染色。绿色：Tspan4-GFP；红色：WGA；青色：Calnexin

负染电镜结果

1. 细胞系选择？

贴壁且迁移能力较强的细胞可产生迁移体，但本身迁移能力较弱或是编辑、处理后迁移能力较低的细胞迁移体产量较少。

细胞系和原代细胞均可产生迁移体，产生能力与细胞本身性质相关，需要使用者进行测试摸索。目前发现，免疫细胞、上皮细胞、成纤维细胞、间充质干细胞（MSC）均可较好产生迁移体。

悬浮的细胞可以用多种方法促进贴壁，部分悬浮的细胞可通过这种方法适配本试剂盒生产迁移体，例如多种免疫细胞（T/B/neutrophil/NK等）可在Fibronectin处理后贴壁并产生迁移体。具体贴壁方法及迁移体产量需要使用者进行测试摸索。

2. 如何提高迁移体产量？

建议正式生产迁移体前，使用WGA染料（参考Chen, L., Ma, L. & Yu, L. Cell Discov 5, 13 (2019)）对迁移体进行原位染色，并在镜下观测迁移体生产效果。需要注意的参数包括：

(1) 细胞本身性质：如同上文1.细胞系选择中所述，不同细胞间迁移体产生能力差距很大，在细胞系可以选择的实验中，迈格松推荐使用者对可选的细胞系进行初步迁移体产生能力测试，筛选迁移体产生能力较好的细胞系进行测试。此外，部分细胞系可通过过表达Tspan4、Integrin a5等迁移体形成相关基因促进迁移体生成并增加迁移体稳定性，使用者可根据实验需求进行选择。

(2) 细胞密度：迁移体需要在细胞迁移过程中产生，细胞不宜过于密集，否则会影响迁移空间，降低产量；此外，由于迁移体会介导细胞与细胞间的信息与物质传递（Zhu, M., Zou, Q., Huang, R. et al. Cell Res 31, 237–240 (2021))，过于密集的细胞会将已经产生的迁移体进行吞噬。根据我们的经验，考虑到不同细胞的迁移速率，应将收集时细胞汇聚度控制在20%-40%之间，迁移较快的细胞密度应适当降低。

(3) 表面处理：迁移体生产依赖于细胞表面与培养介质表面的互相作用，尤其是Integrin的配对。不同细胞所含integrin的种类及含量均有所不同，导致其贴附、迁移性质有所不同，进而导致迁移体产量不同；此外，部分细胞还会自己分泌胞外基质（ECM），从而改变其与培养介质的互相作用。因此，合理的表面处理（ECM类型、浓度等）会明显影响细胞迁移体形成的性质和产量，需要根据具体情况进行摸索和优化。从经验来说，合适浓度的Fibronectin处理可以促进多种细胞迁移体生产，但并非所有细胞都适合使用Fibronectin处理培养表面，例如一些贴壁极其牢固的细胞，及缺乏与Fibronectin配对integrin种类的细胞。

(4) 生产时间：迁移体生产时间需要严格控制。时间过长：迁移体最初在收缩丝上生成，但随着细胞远离迁移体，收缩丝会逐渐断裂，部分迁移体也会脱离皿底被释放到上清中；同时，较长的培养时间也会增加其他细胞吞噬已产生迁移体的概率。时间过短：迁移体产生依赖于细胞迁移，过短的时间细胞迁移较少，迁移体产生也较少。此外，细胞本身性质也会影响到迁移体生产需要的时间和迁移体的稳定性，因此，迈格松推荐使用者对生产细胞进行测试，寻找迁移体产量较多的时间；根据经验，一般在12-18小时之间。

(5)消化方式及时间：过弱的消化方式会残留较多迁移体，降低产量；过强的消化及吹打则会增加细胞破碎几率，降低样品纯度。因此，迈格松推荐客户对于消化时间和吹打次数进行预实验，使用Histone H3（核）、Calnexin（内质网）等标记物含量判断产物中杂质含量，平衡得率和纯度。

(6) 实验仪器：离心机，尤其是其角转子倾斜角度，对于迁移体离心效率和得率较为关键。根据经验，迈格松推荐倾斜度>45°的角转子（例如Eppendorf的台面离心机）进行离心。

(7) 实验耗材：迈格松推荐使用低吸附的EP管及吸头，降低黏附和样品损失。迈格松已对市场上的15mL及50mL离心管进行测试，并选出了得率最高的耗材，有需求的客户可联系我们订购。

3. 样本保存方法？是否可冻存？

粗提及纯化后的迁移体保存方式应依据后续实验进行选择。关注于内容物或是可以固定储存的实验，例如核酸提取、WB、质谱、切片电镜等，可以在20,000xg离心后，去除上清，将迁移体沉淀保存于-80℃以待后续实验。关注形态、数量、表面性质、活性的后续实验，例如共聚焦成像、囊泡计数、流式检测、普通负染电镜、细胞功能实验等，推荐4℃保存，经过多次测试，迁移体在一周内4℃保存对其形态、数量影响均较小。-20℃及-80℃冻存后，迁移体会发生聚团及一定的破裂现象，且不同细胞来源的迁移体有一定不同，若样品因各种原因需要冻存，推荐进行一定预实验进行测试。

4. 迁移体不纯？

可在粗提阶段尝试降低消化力度及吹打力度，或是降低每次精提中使用的粗提产物量。

5. 如何对产品进行鉴定确认其为迁移体？

确信度最高的鉴定方法为形态学鉴定，即在电镜中可观测到包含部分收缩丝的0.5μm-2μm囊泡；除此之外，可以通过标记物组合去判断迁移体富集程度，例如应该上调迁移体标记物（如ITGA5, ITGA4等），下调细胞标记物（Histone H3，Calnexin等），下调其他囊泡标记物（如Tsg101、Alix、Arf6等），包含迁移体来源细胞表面标记物（例如中性粒细胞 CD66B、CD16等）。

需要注意的是，本试剂盒在纯化迁移体前，已经将培养基弃置并清洗细胞，因此，本试剂盒产出的迁移体中外泌体、MV等其他囊泡污染较少，但需要尽量排除胞体碎片等污染物。